Épaisseur de tranche optimale pour une précision améliorée de l'analyse quantitative de la distribution des cellules fluorescentes et des microsphères dans la cryo

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 10907 (2023) Citer cet article

428 accès

Détails des métriques

La cryo-imagerie a été utilisée efficacement pour étudier la biodistribution de cellules ou de microsphères fluorescentes dans des modèles animaux. L’imagerie fluorescente séquentielle tranche par tranche permet la détection de cellules ou de microsphères fluorescentes pour une quantification correspondante de leur distribution dans les tissus. Cependant, si les tranches sont trop fines, il y aura une surcharge de données et des temps d'analyse excessifs. Si les tranches sont trop épaisses, des cellules peuvent manquer. Dans cette étude, nous avons développé un modèle de détection de cellules ou de microsphères fluorescentes pour faciliter la détermination optimale de l’épaisseur des tranches. Les facteurs clés comprennent : l’épaisseur de la section (X), l’intensité des cellules fluorescentes (Ifluo), le coefficient d’atténuation efficace des tissus (μT) et un seuil de détection (T). Le modèle suggère une valeur d'épaisseur de tranche optimale qui offre une sensibilité presque idéale tout en minimisant le temps de numérisation. Le modèle suggère également une méthode de correction pour compenser les cellules manquées dans le cas où les données d'image ont été acquises avec une épaisseur de tranche trop importante. Cette approche permet aux opérateurs de cryo-imagerie d’utiliser des tranches d’épaisseur plus grande pour accélérer le temps d’analyse sans perte significative du nombre de cellules. Nous avons validé le modèle en utilisant des données réelles provenant de deux études indépendantes : des microsphères fluorescentes dans un cœur de porc et des cellules souches marquées par fluorescence dans un modèle de souris. Les résultats montrent que les relations entre l'épaisseur de tranche et la sensibilité de détection issues des simulations et des données réelles correspondaient bien avec une corrélation de 99 % et une erreur quadratique moyenne (RMS) de 2 %. Nous avons également discuté des caractéristiques de détection dans des situations où les hypothèses clés du modèle n'étaient pas satisfaites, telles que la variation de l'intensité de fluorescence et la distribution spatiale. Enfin, nous montrons qu'avec des réglages appropriés, la cryo-imagerie peut fournir une quantification précise de la biodistribution des cellules fluorescentes avec des taux de récupération (nombre de détections/livraison) remarquablement élevés. La technologie de cryo-imagerie ayant été utilisée dans de nombreuses applications biologiques, nos méthodes optimales de détermination de l’épaisseur des tranches et de correction des données peuvent jouer un rôle crucial dans l’amélioration de sa convivialité et de sa fiabilité.

La cryo-imagerie est une technologie d'imagerie microscopique 3D qui permet la localisation de cellules fluorescentes partout chez une souris ou un rat entier avec une sensibilité unicellulaire1,2,3,4,5,6,7,8,9. Le système se compose d’un cryostat à microtome motorisé, d’un microscope doté de capacités de fond clair et fluorescent, d’un positionneur robotique et d’un logiciel de contrôle. Pour réaliser la cryo-imagerie, les tissus d'intérêt sont surgelés à l'aide d'azote liquide et fixés à une étape de coupe et une alternance de coupe et d'imagerie est utilisée. Le système acquiert des images carrelées, à grand champ de vision, à haute résolution (~ 10 µm), en couleur sur fond clair et fluorescentes du tissu. En empilant des tranches d’images, des volumes d’images 3D peuvent être générés pour la visualisation et l’analyse de la biodistribution. Ces caractéristiques exceptionnelles rendent la cryo-imagerie unique par rapport à d'autres modalités 3D in vivo telles que l'imagerie par résonance magnétique (IRM) ou l'imagerie par bioluminescence (BLI). Bien que de telles modalités d’imagerie in vivo puissent imager un animal entier, elles ne disposent pas d’une résolution adéquate et ne peuvent produire que des images en niveaux de gris. Grâce aux caractéristiques susmentionnées, la cryo-imagerie comble une lacune critique dans d’autres modalités d’imagerie pour la recherche biologique.

La cryo-imagerie a été utilisée pour étudier les biodistributions de cellules ou de microsphères fluorescentes dans divers modèles animaux, notamment les petits rongeurs2,3,4,6,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. ,20, chiens7,21, porcs5,22,23 et autres modèles animaux24. Burden-Gulley et al.13,14,15 ont utilisé la cryo-imagerie pour visualiser les comportements migratoires et invasifs des cellules de glioblastome dans un modèle murin. Récemment, nous avons développé une plateforme basée sur la cryo-imagerie pour quantifier et évaluer les métastases fluorescentes dans tout le corps de la souris4,17,18,19. La plateforme s'est avérée adaptée à l'évaluation et à l'optimisation de pipelines de technologies (agents d'imagerie, méthodes d'imagerie, thérapies, modèles de tumeurs, etc.) essentielles à la détection, à la compréhension et au traitement du cancer métastatique. De nombreux groupes7,8,24,25, y compris le nôtre5,26, ont utilisé cette technologie pour résoudre spatialement la perfusion myocardique 3D quantitative à haute résolution via la méthode de piégeage des microsphères fluorescentes. Van Horssen à el. a également utilisé cette technologie pour visualiser la biodistribution des microsphères fluorescentes7,21,22,23,27 et des monocytes6 marqués par fluorescence afin d'étudier les propriétés de la progression de la néovascularisation coronarienne dans les cœurs d'animaux. De plus, nous avons déjà utilisé la technologie de cryo-imagerie pour étudier la biodistribution du corps entier de cellules souches injectées par voie intraveineuse et de cellules immunitaires induisant la maladie dans un modèle murin de maladie du greffon contre l'hôte (GVHD)2,3,9,10,11,12. ,20,28,29. Des exemples d'images fluorescentes montrant les signaux des microsphères et les signaux des cellules souches sont présentés dans le document supplémentaire. Compte tenu de la grande utilité de la cryo-imagerie dans la recherche en imagerie biomédicale, les applications utilisant cette technologie sont de plus en plus nombreuses.

100 µm) is often chosen. The benefits of a larger section thickness include faster imaging and computing times, less memory usage, and longer life for the sectioning knife. However, signals of dimly fluorescent cells embedded in a thick tissue may not reach the surface and may not be detected by the imaging system. The physics of signal loss can be described by the principles of light absorption and scattering in the biological tissue30,31,32,33. In general, by setting a slice thickness that is too large, a significant rate of false negatives can be expected. This would render the results unreliable, particularly in applications that demand accurate absolute quantification. On the other hand, if one sets the slice thickness to be too small, although accurate quantification can be obtained, it would not be computationally or economically efficient. For example, a tissue which can be imaged overnight (12 h) at 120 µm slice thickness will take 3 days (72 h) to scan at 20 µm. There is expected to be an optimal value for slice thickness that will give accurate cell/microsphere counting at a reasonable scan time./p>

20 µm, the number of detected cells will be less than the true number of cells in the tissue as shown in Fig. 3. This situation leads to false negatives. Next, we will propose a mathematical model of the relationship between the fluorescent cell detectability and the slice thickness especially in the sub-optimal range (X > Xoptimal)./p> Xoptimal), the number of detected cells decreases as the slice thickness increases. By formulating the mathematical relationship, one can predict the cell loss and even estimate a correction factor to compensate for the under-sampling. In this section, we aim to construct the relationship under some simplifications./p> Xoptimal (which implies e/X < 1.0), the number of observed cells (n) is reduced from the total cells in the sample (N) according to the relative distribution, d(x), of cells lying in a given slice. The distribution of cells is therefore also related to the probability of a cell being at a given distance, p(x). This can be formulated as/p> Xoptimal), the detection sensitivity decrease as the slice thickness increases. Also, remind that for all X values that are less than or equal to Xoptimal, the Sens value will be 100%. By combining X values from both ideal range (X ≤ Xoptimal) and sub-optimal range (X > Xoptimal), we obtain:/p> Xoptimal) would adversely affect the sensitivity. Three cell intensities were chosen for this simulation: Ifluo = 30, 50 and 80 (grayscale intensity). The numbers were chosen from the intensity distribution of cells derived from our stem cell imaging database. Parameters T and μT were set to 10 (gray level) and 314 cm−1, respectively. The detection threshold value (T) was empirically estimated based on the signal-to-noise-ratio (SNR) in our image data. The value of μT was estimated from mouse tissues in our database using an exponential fitting method proposed by Steyer et al.34. The programming platform used in this study was Matlab 2022a (MathWorks, USA)./p>

Xoptimal), the curve appeared as the reciprocal function derived in Eq. (14). By showing the relationship on a log–log scale, the relationship is shown to be perfectly linear (Fig. 6B), as predicted by the mathematical derivation described in Section “In silico simulations for non-compliant situations”./p> Xoptimal)./p> Xoptimal) (Fig. 10C,D)./p> Xoptimal). After running in silico simulations based on the assumptions, we made the following observations. When X ≤ Xoptimal, the Sens value was constant at 100%, but when X > Xoptimal, it decreased as a non-linear function of X (Fig. 6A). The relationship in the sub-optimal range was shown to be a reciprocal function of X Eq. (14). When plotted on a log–log scale, the relationship was linear with a slope of -1 (Fig. 6B). We speculate that this relationship would hold true for real data if the fluorescent cells behaved in a manner that was consistent with our key assumptions. Please note that we also developed a probabilistic model to predict the sensitivity profile in cases where the cell distribution is not uniform Eqs. (7)–(10) and with varying intensity Eqs. (16)–(17)./p> Xoptimal). In many applications, it is necessary for cryo-imaging users to choose a larger slice thickness in order to analyze a large piece of tissues such as pig hearts5,22,23,27, dog hearts7,21, or rabbit tissues24. As the sample volume is prohibitively large, a much larger slice thickness should be selected in order to efficiently optimize the imaging time, the memory space, and other costs. However, the larger the slice thickness beyond the Xoptimal value was, the higher the number of false negatives. In order to mitigate this issue, we propose that the relationship derived in Eqs. (14)–(15) can be used to estimate the true number of cells/microspheres. For example, if researchers conducted a microsphere biodistribution study in a large animal and needed to set a large slice thickness, say X = 100 μm while Xoptimal = 58 μm. By doing so, the cell signals acquired in their image data could be obtained with the sensitivity of only 58% (42% lost) as suggested by Eqs. (14)–(15). For correcting this, one may consider multiplying the number of found microspheres by a factor of 1/Sens (1/0.58 in our example) for estimating the true number of fluorescent microspheres in the tissue. This knowledge allows cryo-imaging operators to use larger slice thickness (much larger than Xoptimal) without significant loss of the microspheres. Such corrections could enable reduced scanning time of a large tissue such as a pig heart, going from days or weeks to hours or days. This finding makes that analyses feasible that may not previously be otherwise./p>

Blog

Épaisseur de tranche optimale pour une précision améliorée de l'analyse quantitative de la distribution des cellules fluorescentes et des microsphères dans la cryo